Virology Journal volumen 19, Número de artículo: 106 (2022) Citar este artículoEste artículo ha sido actualizadoLa citoquina MDA-7/IL-24 ha mostrado potentes propiedades antitumorales en varios tipos de cáncer sin ejercer ninguna toxicidad significativa en las células sanas.También se ha demostrado que abarca un comportamiento similar al de las citoquinas Th1 proinmunes.Se han desarrollado varias vacunas de ADN E7 contra el cáncer de cuello uterino relacionado con el virus del papiloma humano (VPH).Sin embargo, la inmunogenicidad restringida ha limitado sus aplicaciones clínicas individualmente.Para abordar esta deficiencia, investigamos si la combinación de la vacuna de ADN E7 con MDA-7/IL-24 como adyuvante provocaría respuestas antitumorales eficientes en modelos de ratones con tumores.A continuación, evaluamos cómo la supresión de la citoquina IL-10 inmunosupresora mejoraría el resultado de nuestra vacuna adyuvante candidata.Para este propósito, los ratones portadores de tumores recibieron la vacuna de ADN E7, la citocina MDA-7/IL-24 o una combinación de la vacuna E7 con el adyuvante MDA-7/IL-24 una semana después de la exposición al tumor y se reforzaron dos veces con un intervalo de una semana. .El bloqueo de IL-10 se realizó mediante inyección de mAb anti-IL-10 antes de cada inmunización.Una semana después de la última inmunización, se sacrificaron los ratones y se evaluó la eficacia del tratamiento mediante análisis inmunológico e inmunohistoquímico.Además, se controló el estado de los tumores cada dos días durante intervalos de seis semanas a partir de la semana 2, y se midió y comparó el volumen del tumor dentro de diferentes grupos.Se observó una relación sinérgica muy significativa entre la vacuna de ADN E7 y la citocina MDA-7/IL-24 contra modelos de cáncer de cuello uterino VPH-16+.Un aumento en la proliferación de linfocitos, la citotoxicidad de las células T CD8+, el nivel de citoquinas Th1 (IFN-γ, TNF-α) e IL-4, el nivel de marcadores apoptóticos (TRAIL y caspasa-9), y una disminución en la El nivel de citocina inmunosupresora IL-10, junto con el control del crecimiento tumoral y la inducción de la regresión tumoral, demuestran la eficacia de la vacuna adyuvante E7 e IL-24 en comparación con su administración individual.Sorprendentemente, la vacunación con el ADN E7 e IL-24 redujo significativamente la población de células T reguladoras (Treg) en el bazo de los ratones inmunizados en comparación con la administración única y los grupos de control.Además, el bloqueo de IL-10 mejoró el efecto de la coadministración al provocar niveles más altos de IFN-γ y caspasa-9, reduciendo la secreción de IL-10 y provocando la regresión del tamaño del tumor.La sinergia entre la vacuna de ADN E7 y MDA-7/IL-24 sugiere que la baja inmunogenicidad de las vacunas de ADN se puede abordar de manera eficaz combinándolas con un agente inmunorregulador.Además, el bloqueo de IL-10 puede considerarse un tratamiento complementario para mejorar el resultado de las terapias contra el cáncer convencionales o novedosas.La inmunización con vacunas de ADN, que expresan un antígeno extraño, representa un método simple y efectivo para generar inmunidad celular y humoral específica de antígeno en varios modelos animales [1, 2].Debido a la captación celular y al aumento de la expresión de antígenos dentro de las células huésped, las vacunas de ADN pueden estimular respuestas inmunitarias específicas en modelos de ratones sin causar infecciones patogénicas in vivo [3, 4].Sin embargo, las vacunas de ADN no se usan mucho debido a su inmunogenicidad limitada, especialmente en animales grandes y en ensayos clínicos [5].Por lo tanto, varios enfoques han intentado promover la inmunogenicidad y la eficacia de las vacunas de ADN, particularmente la incorporación de adyuvantes inmunes codificados genéticamente destinados a mejorar la inmunogenicidad de los antígenos [6].La administración de adyuvantes genéticos no solo aumenta la cantidad sino que también modula el tipo de respuestas inmunes a las vacunas de ADN [7].Dichos adyuvantes comprenden moléculas inmunomoduladoras codificadas por plásmidos, que incluyen citocinas, quimiocinas, moléculas inmunoestimuladoras como el receptor tipo toll (TLR), agonistas y factores reguladores del interferón (IFN), o inhibidores de vías inmunosupresoras [2, 8].Después de descubrir el gen 7 asociado a la diferenciación del melanoma (MDA-7) en 1993, el comportamiento similar a las citoquinas de MDA-7 junto con la existencia de una firma de la familia IL-10 entre la secuencia del gen MDA-7 alentó a la Organización de Genes Humanos a lo titulan IL-24, que en conjunto constituyen su nombre, el MDA-7/IL-24 [9].El MDA-7/IL-24 ha mostrado una prometedora actividad terapéutica contra el cáncer en ensayos clínicos [10, 11].Existe una amplia gama de mecanismos a través de los cuales MDA-7/IL-24 actúa como un potente agente anticancerígeno, incluida la inducción de la apoptosis y la autofagia, la regulación de la angiogénesis, la invasión y la metástasis, la propagación de respuestas anticancerígenas a células malignas cercanas a través del efecto espectador, así como la mejora de la función anticancerígena de otros métodos terapéuticos como agente sinérgico [12].Recientemente, se ha informado que MDA-7/IL-24 aumenta la frecuencia de las células T CD8+ que expresan IFN-γ e influye en el desarrollo de respuestas inmunitarias antitumorales, lo que sugiere que MDA-7/IL-24 es una citoquina pro-Th1 [13 ].Sin embargo, el papel de MDA-7/IL-24 en la estimulación de las respuestas de células T específicas de antígeno inducidas por la vacuna sigue sin estar claro.Por lo tanto, en el estudio actual, evaluamos si MDA-7/IL-24 podría ser un adyuvante de vacuna candidato para inducir inmunidad celular específica de antígeno y mejorar las respuestas inmunitarias antitumorales en un modelo de ratón del tumor asociado con el VPH cuando se combina con un E7 vacuna de ADN.Además, debido al papel de la citocina IL-10 en la progresión de las células de cáncer de cuello uterino positivas para VPH [14], evaluamos si el bloqueo de IL-10 mejoró la eficacia de la vacuna candidata E7 e IL-24 contra las células tumorales TC-1.La línea de células tumorales murinas, TC-1, parte de la colección especial de Johns Hopkins, derivada de células epiteliales primarias de ratones C57BL/6, cotransformadas con HPV16 E6 y E7, y oncogén c-Ha-ras activado, luego se usó para inducir la formación de tumores dentro de los grupos estudiados (sistema murino H-2b).Las células EL4, una línea celular de linfoma de ratón derivada de ratones C57BL/6-Ly5.2 y células de riñón embrionario humano (HEK-293T) se obtuvieron del Banco Nacional de Células de Irán (NCBI, Instituto Pasteur, Teherán).En este estudio, la línea celular EL4, que presenta el péptido E7, se empleó como diana en el ensayo de citotoxicidad (ensayo LDH).Se usó la línea celular HEK-293T para confirmar la expresión del adyuvante genético recombinante.En el primer paso, las líneas celulares se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) suplementado con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10 % (Gibco, Thermo Fisher Scientific, EE. UU.), insulina, factor de crecimiento, L-glutamina 2 mM, piruvato 1 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, penicilina 100 unidades y estreptomicina 100 μg.Se compraron ratones hembra C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad del Instituto Pasteur de Irán.Se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a una temperatura ambiente entre 20 y 22 °C y tenían libre acceso a comida y agua.Todas las manipulaciones de animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Comité Ético para el uso y cuidado de animales de laboratorio del Instituto Pasteur de Irán (número de ética: et-1137).Las construcciones de plásmidos recombinantes se verificaron mediante secuenciación de ADN y expresión génica.Brevemente, las células competentes de la cepa bacteriana DH5α de E. coli (Instituto Pasteur de Irán) se transformaron a través del método CaCl2 y luego se cultivaron en medio Luria-Bertani (LB) para amplificar los plásmidos.Se purificaron reservas de vacunas de ADN libre de endotoxinas, pcDNA3.1-MDA/IL-24 y plásmidos de control de vectores (pcDNA3.1) en PBS 0,1 M para la vacunación utilizando el EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) con ADN siendo disuelto en Tris-EDTA libre de endotoxinas (Sigma, St. Louis, MO).La confirmación de plásmidos recombinantes se logró mediante análisis de restricción.La expresión de E7 en la vacuna de ADN se confirmó en nuestro estudio anterior [1].La transfección para la expresión transitoria de MDA/IL-24 en la línea celular de riñón embrionario humano-293 (HEK-293) se llevó a cabo con un reactivo Lipofectamine 2000 según las instrucciones del fabricante (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.).La expresión de MDA/IL-24 (pcDNA3.1-MDA/IL-24) por células HEK293 transducidas se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal contra MDA/IL-24 (R&D. cat number: MAB2786).Como control, se utilizó lisado de células enteras de células HEK 293T transfectadas con un plásmido de expresión pcDNA3.1 vacío.Los ratones C57BL/6 fueron desafiados mediante inyección subcutánea (SC) con 7 × 105 células TC-1 (ATCC) en 100 μL de PBS, que expresan constitutivamente HPV16 E6/E7 de tipo salvaje.Los ratones (n = 10) se dividieron aleatoriamente en cinco grupos (10 ratones por grupo).Después de una semana, los ratones fueron inmunizados con diferentes formulaciones.A dos grupos se les administró por vía intratumoral 90 μg del plásmido que codifica HPV-16 E7 (vacuna de ADN) o el plásmido que expresa MDA/IL-24 (pcDNA3.1-MDA/IL-24, adyuvante de control) tres veces a los siete días. intervalosSe aplicó el mismo programa de inmunización al grupo de vacuna con adyuvante (E7 e IL-24) utilizando la vacuna de ADN que codifica HPV-16 E7 (90 μg) en combinación con 90 μg del plásmido que expresa MDA/IL-24.El pcDNA3.1 y la solución salina tamponada con fosfato (PBS) se usaron como grupos de control.El tamaño del tumor se midió con calibradores de tejido cada dos días y el volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula de Carlsson [15].El volumen medio del tumor (eje Y) se trazó para mostrar las curvas de crecimiento in vivo (siete ratones por grupo) usando la fórmula: volumen = (ancho) 2 × largo/2.Se examinó el crecimiento del tumor durante al menos cuarenta y dos días.Los diferentes aspectos de la inmunidad (proliferación de linfocitos (MTT), citotoxicidad (LDH), niveles de citocinas (ELISA) y población de células T reguladoras (citometría de flujo)) se estudiaron una semana después de la tercera administración.Los resultados son representativos de tres experimentos independientes (tres ratones por grupo).El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA de una vía.Los datos finales representan la media ± desviación estándar (DE) de tres mediciones.La descripción esquemática de todos los procedimientos experimentales se ha representado en la Fig. 1.Resumen esquemático de todos los análisis desde el día 0 hasta el día 42. Brevemente, 1 semana después de la exposición al tumor (día 0), los ratones se inmunizaron con E7, IL-24 o E7 e IL-24;o recibieron reactivos de control (pcDNA o PBS).Este procedimiento se repitió 2 veces con un intervalo de una semana.Una semana después (día 28), se realizaron experimentos sobre proliferación de linfocitos, secreción de citoquinas (usando ELISA), respuestas de CTL, niveles de caspasa-9 y TRAIL (usando ELISA), población de Treg (usando citometría de flujo) e inmunohistoquímica anti-IL-24. .Finalmente, el día 42 se realizó el último análisis tumoral (siguiendo la rutina de monitorización cada 2 días a partir del día 14), y se aplicó la interpretación de datos.Paralelamente (como se muestra en la línea de tiempo), un grupo de ratones recibió anti-IL-10 un día antes de cada inmunización.El día 28 se midió el nivel de IFN-γ, así como de caspasa-9.El día 42, se obtuvieron los datos tumorales finales y se compararon con los resultados de los grupos de control de isotipo.Descripción de los colores de las etiquetas en los cuerpos de los ratones: rojo = ratón con tumor;azul = ratón inmunizado;verde = ratón anti-IL-10 recibidoUna semana después de la última vacunación, se midió la proliferación de linfocitos de esplenocitos (tres ratones/grupo).Los bazos recogidos de ratones individuales se trituraron y se pasaron a través de un tamiz de nailon, y los glóbulos rojos se lisaron usando un tampón de lisis de glóbulos rojos que contenía NH4Cl al 0,75 % en tampón Tris.Se prepararon suspensiones de células individuales de ratones en cada grupo en condiciones estériles.El número de células y la viabilidad se determinaron mediante la prueba de exclusión con azul de tripán [3].Los esplenocitos a una concentración de 2 × 105 células/pocillo se propagaron en las placas de 96 pocillos en presencia de 1 μg de epítopo CTL H-2Db específico de E749–57 sintético (biomatik, Canadá) o en ausencia de estímulos (solo medio). ).La evaluación de la proliferación de linfocitos se realizó utilizando el kit MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) (Sigma), basado en reacción colorimétrica.Después de 72 h de incubación a 37 °C y 5 % de CO2, se añadió a cada pocillo 10 μg/μl de la solución de MTT.Luego, se incubaron en las mismas condiciones durante cinco horas.Al final del período de incubación, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 100 μl de la solución tampón a los pocillos para formar cristales de formazán solubles de color púrpura.La placa se leyó utilizando un lector ELISA (BIOTEK) a 540 nm y se registró la DO para calcular el índice de estimulación (SI).El SI se determinó mediante la fórmula: SI = (Cs _ Cu) ∕ Cu, en la que Cs es la OD de las células estimuladas y Cu representa el número relativo de células de las células no estimuladas.La actividad de CTL se analizó mediante el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) [15].Una semana después de la última administración, se prepararon suspensiones unicelulares de esplenocitos y se usaron como células efectoras.Células EL4 (como células diana estimuladas con 1 μg/μl del epítopo sintético específico de E7 (epítopo CTL H-2Db)) en un volumen de 100 μl se incutieron con células efectoras (100 μl) en diferentes proporciones efectoras/objetivo.La liberación de LDH tras la lisis celular se midió con un kit de ensayo de liberación de LDH (Takara) según las instrucciones del fabricante.Para los controles bajo y alto (liberación espontánea y liberación máxima, respectivamente), se añadieron 100 μl de medio de ensayo o Triton X-100 al 2%.El porcentaje de citólisis específica se calculó mediante la fórmula:Una semana después de la última inmunización, los esplenocitos de los ratones inmunizados se cultivaron en placas de 24 pocillos durante tres días en RPMI 1640 sin rojo fenol suplementado con FBS al 10 %, L-glutamina 2 mM, HEPES 25 mM y penicilina/estreptomicina al 0,1 %. y se pulsó con 1 μg/ml de epítopo CTL H-2Db específico de E7 a 37 °C en CO2 al 5 %.Se analizó la presencia de IFN-γ, IL-4, IL-10 y TNF-α en los sobrenadantes utilizando kits ELISA basados ​​en sándwich disponibles comercialmente (R&D Systems, San Diego, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.Para comprender el papel de la apoptosis intrínseca en las respuestas antitumorales de la vacuna propuesta, se midió el nivel de caspasa-9 y TRAIL en el microambiente tumoral mediante el kit caspasa ELISA (Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.) y Mouse TRAIL ELISA kit (Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.), respectivamente.Brevemente, una semana después de la tercera vacunación, se extrajo el tejido tumoral de cada grupo (n = 3) y se homogeneizaron 100 mg de tejido descartado en 0,5 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 0,1 M pH = 7,6 y ditiotreitol fresco 0,1 M). ).Después de la centrifugación a 10 000 × g (1 min), se añadió una cantidad igual de sobrenadante al tampón de reacción que contenía el sustrato (ditiotreitol 0,1 M y 5 μl de DEVD-p-NA 4 mM) y se incubó durante 120 min a 37 °C. .Finalmente, la actividad de caspasa-9 y TRAIL se evaluó mediante el lector de microplacas (BioTek, 800TS, EE. UU.) a una absorbancia de 405 nm.Cada experimento se repitió por triplicado.Para evaluar la población de células T reguladoras (Treg) en el bazo de ratones inmunizados, los esplenocitos recién preparados se analizaron mediante citometría de flujo utilizando el kit de tinción de células T reguladoras de ratones de eBioscience.Brevemente, se cultivaron esplenocitos (1 × 106/pocillo) durante 5 h en RPMI-1640 completo solo (control negativo) o cocultivados con antígenos de epítopo CTL H-2Db específicos de E7.Los anticuerpos y reactivos utilizados para la tinción fueron los siguientes: anti-CD4 conjugado con FITC, anti-CD25 conjugado con APC y marcador interno (Foxp3 (PE)).Las muestras se analizaron utilizando un dispositivo de citometría de flujo BD FaxCalibur.Los tumores TC-1 trasplantados se recolectaron, se fijaron en una solución de formaldehído al 10 %, se incluyeron en parafina y se cortaron en rodajas usando procedimientos estándar.Después de la recuperación del antígeno (tampón de citrato de sodio 10 mM, pH = 6,0), las peroxidasas endógenas se bloquearon con peróxido de hidrógeno al 3% en PBS durante 10 min.A continuación, las secciones de tejido se trataron con el anticuerpo primario anti-IL-24 (R&D Systems) diluido a concentraciones de 1:500 en tampón de bloqueo durante 24 h a 4 °C.Posteriormente, las secciones se trataron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) en diluciones de 1:100 y se visualizaron usando DAB más sustrato cromógeno (Dako, Agilent, CA, EE. UU.) y contratinción de hematoxilina.Con respecto a la cuantificación, se contaron cinco campos de visión de al menos cuatro secciones de tejido separadas para cada grupo (n = 3) usando el software image J.Se estimó el número de células positivas teñidas de marrón sobre el número total de células y se usó para determinar el porcentaje (%) del área de tinción.Para evaluar el efecto de la inhibición de la citoquina IL-10 inmunosupresora en el resultado de la vacuna candidata y un día antes de cada inmunización, se inyectó intraperitonealmente (ip) a ratones (n = 10) con 1 mg de anti-IL -10 receptor (IL-10R) mAb (Biolegend; clon 1B1.3a), que se une específicamente al dominio de unión al ligando de IL-10R, o con control de isotipo IgG1 mAb (Biolegend).Siete días después de la última vacunación (veintiocho días después de la exposición al tumor), se determinaron los niveles de IFN-γ e IL-10 específicos de E7 en el bazo y el nivel de caspasa-9 en el microambiente tumoral (n = 3). (como se describió anteriormente).También se controló el volumen del tumor hasta seis semanas después de la exposición al tumor (n = 7) como se describe en la sección anterior.Para comparar los resultados entre los diferentes grupos, se realizó el análisis de varianza univariado (ANOVA) de una vía más comparaciones múltiples.Para el análisis estadístico se utilizó el software estadístico SPSS 11.0.Se consideró que los valores de probabilidad de *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001 demostraban significación estadística.La expresión de MDA-7/IL-24 se verificó mediante western blot con anti-IL-24 (Archivo adicional 1: Fig. S1).El ensayo de transferencia western demostró la presencia de IL-24 como una única banda de 24 kD en las muestras en comparación con el vector de control (control pcDNA 3.1).Se usó LPA para evaluar las respuestas de linfocitos T específicas de E7.Se observó que LPA fue estadísticamente significativo (P < 0,001) en el grupo E7 e IL-24 en comparación con los grupos E7 e IL-24.Además, aunque LPA fue significativamente mayor (P < 0,001) en todos los grupos de estudio (E7&IL-24, E7 e IL-24) en comparación con los grupos de control (PBS y pcDNA3), no se observaron diferencias significativas entre E7 e IL. -24 grupos (fig. 2).Los hallazgos informan de un sinergismo significativo entre la vacuna de ADN y el adyuvante genético y el potencial de la IL-24 como adyuvante para la inducción de inmunidad celular.Proliferación de esplenocitos de ratones BALB/c inmunizados después de la reestimulación in vitro con epítopo sintético específico de E7.Se recogieron esplenocitos de ratones una semana después de la última inmunización, y el ensayo MTT evaluó la proliferación de linfocitos.Los resultados representan la media ± DE de 3 ratones por grupo.***Diferencias estadísticamente significativas entre el ADN de E7 más el adyuvante IL-24 en comparación con otros grupos (ADN de E7, IL-24, pcDNA, PBS) según lo determinado por ANOVA de una vía (P < 0,001)Para estudiar si el adyuvante IL-24 en combinación con la vacuna de ADN puede aumentar una acción citotóxica específica contra los tumores trasplantados, se evaluaron las respuestas de los linfocitos T citotóxicos una semana después de la última inmunización.La respuesta de citotoxicidad en ratones vacunados se examinó utilizando la liberación de LDH de las células muertas.Se reestimularon in vitro linfocitos citotóxicos de esplenocitos de ratones aplicando el epítopo antigénico de la proteína E7 procesada por células EL4.Como se muestra en la Fig. 3, la actividad citotóxica fue significativamente mayor (P < 0,001) en el grupo E7 e IL-24 en comparación con los grupos E7 e IL24.No se detectaron diferencias significativas entre los grupos E7 e IL-24 en términos de liberación de LDH;sin embargo, hubo un aumento significativo en el nivel de citotoxicidad de todos los grupos de estudio en comparación con los grupos de control (P < 0,001).Parece que la coadministración de E7 e IL-24 puede desarrollar fuertes respuestas CTL específicas entre ratones portadores de tumores (Fig. 3).Las actividades de CTL de los linfocitos de bazo de los ratones portadores de tumores se determinaron mediante un ensayo de liberación de LDH.Se aislaron esplenocitos de ratones inmunizados una semana después del último tratamiento y se incubaron con células EL4;luego, pulsado con epítopo específico de E7 sintético (epítopo CTL H-2Db) a proporciones de células efectoras (esplenocitos) a diana (EL4) (E/T) de 50:1.Los esplenocitos derivados de ratones inmunizados con ADN E7 más IL-24 mostraron una mayor citotoxicidad frente a la reestimulación del epítopo específico de E7 que los de los otros grupos.***Diferencias estadísticamente significativas entre el ADN de E7 más IL-24 en comparación con otros grupos (DNA E7, IL-24, pcDNA, PBS) según lo determinado por ANOVA unidireccional (P < 0,001)Se evaluó el equilibrio de citocinas para determinar si la IL-24 podría potenciar la inmunidad antitumoral de la vacuna de ADN con adyuvante.Para la medición de las citocinas IFN-γ, IL-4, IL-10 y TNF-α, los esplenocitos de los ratones vacunados se cocultivaron con células EL4, que se cebaron con el epítopo antigénico E7 12 h antes.Setenta y dos horas después del cocultivo, se recogió el sobrenadante y se analizó mediante ELISA, y los datos obtenidos se evaluaron mediante la prueba ANOVA de una vía.Como se ilustra en la Fig. 4A, hubo una diferencia significativa (P < 0,001) entre el nivel de IFN-γ en todos los grupos de estudio y de control.Curiosamente, la incorporación simultánea de la vacuna de ADN E7 e IL-24 aumentó notablemente (P < 0,001) el nivel de IFN-γ en comparación con la administración de cada componente solo.Por otro lado, no se observó diferencia significativa entre los grupos E7 e IL-24 en cuanto a la inducción de la expresión de IFN-γ.En general, parece que la IL-24 puede mejorar la inmunidad mediada por células de nuestra vacuna E7 e IL-24 desarrollada probablemente al promover la activación de las células T CD8+ y, por lo tanto, el nivel de IFN-γ.Niveles de mediadores inflamatorios secretados por esplenocitos en ratones inmunizados.Los sobrenadantes de los esplenocitos se volvieron a estimular con un epítopo específico de E7 y se recogieron una semana después de la última inyección.Se realizó el método ELISA para determinar el nivel de IFN-γ (A), IL-4 (B), TNFα (C) e IL-10 (D) en cultivos de esplenocitos.Los resultados son representativos de tres experimentos independientes y se expresan como la media ± DE.El ADN E7 adyuvado con IL-24 indujo niveles sólidos de IFN-γ, IL-4 y TNFα en comparación con los otros grupos (A–C).Además, el nivel de IL-10 (D) en el ADN E7 adyuvado con el grupo de IL-24 se redujo significativamente en comparación con otros grupos (IL-24, pcDNA, PBS).*P < 0,05;**P < 0,01;*** P < 0,001Según los datos de la Fig. 4B, el mayor nivel de producción de IL-4 fue estadísticamente significativo (P < 0,001) en el grupo E7 e IL-24 en comparación con los grupos E7 o IL-24.Si bien se observaron niveles más altos (P < 0,001) de IL-4 en todos los grupos de estudio que en los de control, no se encontraron diferencias significativas en el nivel de IL-4 entre los grupos E7 e IL-24.La mayor producción de IL-4 en el grupo E7 e IL-24 puede ser un signo de la mayor proliferación de linfocitos auxiliares y citotóxicos, que estimulan la inmunidad humoral y adaptativa.La citoquina del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) juega un papel importante en el control y tratamiento de los cánceres, especialmente los tumores sólidos.Como se muestra en la Fig. 4C, hubo una diferencia significativa entre el grupo E7 e IL-24 y los grupos E7 (P < 0,05) e IL-24 (P < 0,001) con respecto a la concentración de TNF-α en las células esplénicas.Además de los niveles más altos (P < 0,001) de TNF-α dentro de todos los grupos inmunizados en comparación con los controles, se detectó una mayor cantidad (P < 0,001) de esta citocina en el grupo E7 en comparación con el grupo IL-24.El mayor nivel de TNF-α en los ratones a los que se administró la vacuna adyuvante probablemente se correlacione con un aumento en los procesos de muerte celular mediados por esta citocina.Con respecto al nivel de producción de IL-10 en los grupos de estudio y como se esperaba, se encontraron cantidades significativamente más bajas (P < 0,001) de citocina IL-10 inmunosupresora en los grupos inmunizados en comparación con los grupos de control.Cabe señalar que, aunque la diferencia entre el nivel de producción de IL-10 en los grupos E7 e IL-24 y E7 no fue significativa, se observó un nivel más bajo (P < 0,05) de IL-10 en el grupo E7 e IL-24 en comparación con el grupo IL. -24 grupo (Fig. 4D).Parece que la IL-24 tiene un impacto ligeramente positivo en el control del nivel de IL-10, destacando así efectos menos perjudiciales de la IL-10 sobre la proliferación de células inmunitarias y la función de las células presentadoras de antígenos.Las células T reguladoras son una subpoblación especializada de células T con la capacidad de regular a la baja el sistema inmunitario [1].Por otro lado, las Treg se consideran los mediadores clave de la progresión tumoral, lo que se asocia con su naturaleza inmunosupresora [5].La población de Treg en el bazo de ratones escarificados se estimó mediante análisis de citometría de flujo.Como se muestra en la Fig. 5, el porcentaje de población de células T reguladoras fue significativamente mayor (P < 0,001) en los grupos de control en comparación con los grupos E7 e IL-24 y E7.Además, la población de Treg se redujo en el grupo de IL-24 al 2% de las células de recuento.También se informó que la población de Treg en el grupo E7 e IL-24 fue significativamente menor que en los grupos E7 único (P < 0,001) o IL-24 (P < 0,01).Por lo tanto, la IL-24 se beneficia de una potente capacidad para suprimir las Treg y, posteriormente, impulsar las respuestas inmunitarias antitumorales.Caracterización del agotamiento de las células T CD4+ CD25+ Foxp3+ en ratones inmunizados.A–E Datos de gráficos de puntos representativos que demuestran la frecuencia de linfocitos CD4+ CD25+ Foxp3+ en los esplenocitos de varios grupos de ratones inmunizados.Los esplenocitos se recolectaron una semana después de la última inyección intratumoral de vacuna de ADN y adyuvante, luego se sometieron a análisis de citometría de flujo usando los anticuerpos anti-CD4, anti-CD25 y anti-Foxp+.Las cifras de la barra F representan los porcentajes de células T CD4+ CD25+ Foxp3+ (Treg) entre las células T CD4+ de los esplenocitos.Los ratones tratados con ADN E7 más IL-24 tenían el número más bajo de células Treg de esplenocitos entre los otros grupos (*** p < 0,001).Los datos demuestran la media ± un error estándar de dos experimentos independientesSe demostró que el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor de necrosis tumoral (TRAIL) media la vía de la apoptosis en las células tumorales sin toxicidad para el huésped [16].Además, la caspasa-9 es un actor clave en la vía apoptótica intrínseca, provocando la apoptosis al iniciar la vía de señalización relacionada con la cascada de caspasa [17].Se midieron TRAIL y caspasa-9 en el microambiente tumoral para investigar el mecanismo a través del cual nuestra vacuna adyuvante desarrollada destruye las células tumorales.Como se predijo, los niveles de ambos factores apoptóticos fueron significativamente más altos (P < 0,001) entre los grupos inmunizados en comparación con los grupos de control.El TRAIL y la caspasa-9 en los ratones tratados con la vacuna adyuvante E7 e IL-24 fueron significativamente más altos (P < 0,001) en comparación con el grupo E7 o IL-24.Además, aunque no se encontraron diferencias significativas entre los grupos E7 e IL-24 en cuanto al nivel de caspasa-9, la concentración de TRAIL en el grupo E7 fue menor (P < 0,05) que la de IL-24 (Fig. 6).En general, estos datos confirmaron el papel rector de la apoptosis en la destrucción de las células tumorales y el control de la progresión del tumor por nuestra vacuna adyuvante propuesta.Los niveles de caspasa-9 y proteínas TRAIL en el microambiente tumoral.Los ratones se expusieron a células tumorales TC-1 y se inmunizaron como se describe en el texto.Una semana después de la inmunización, los grupos de ratones se sacrificaron y el tejido tumoral se extrajo y homogeneizó para formar un lisado tumoral uniforme.La concentración de caspasa-9 (A) y TRAIL (B) en lisados ​​tumorales determinada por ELISA.Los resultados son la media ± SD representativa de tres experimentos independientes.*P < 0,05;*** P < 0,001El reclutamiento de IL-24 en el sitio del tumor fue validado y cuantificado por IHC.Se preparó el tejido tumoral incluido en parafina y fijado en formalina, y los tejidos teñidos se visualizaron después del tratamiento con el anticuerpo anti-IL-24 (Fig. 7A).Según la Fig. 7B, la infiltración de IL-24 en el microambiente tumoral de los grupos inmunizados fue mayor y la diferencia fue estadísticamente significativa en comparación con los grupos control (P < 0,001).Más importante aún, la expresión de IL-24 en el grupo E7 e IL-24 fue significativamente mayor (P < 0,001) en comparación con los grupos E7 e IL-24.Además, el tejido tumoral obtenido del grupo IL-24 contenía una mayor cantidad (P < 0,05) de citocina IL-24 en comparación con el grupo E7 (Fig. 7B).Los datos sugieren el efecto sinérgico de la vacuna de ADN E7 sobre la participación de IL-24 en el sitio del tumor.Detección inmunohistoquímica de IL-24 en tejido tumoral de ratones inmunizados.Los tejidos tumorales se recogieron de ratones sacrificados una semana después de la última inmunización con vacuna de ADN y se determinó la expresión de la proteína IL-24 por IHC (aumento: × 200).Las áreas teñidas de expresión de IL-24 se cuantificaron utilizando el software Image J.El gráfico muestra el porcentaje promedio (%) del área teñida en la sección de tejido tumoral en diferentes *grupos.Los resultados se registraron como la media ± SD de tres experimentos independientes.***P < 0,001;*P < 0,05Este estudio se centró en examinar el efecto de la vacuna de ADN E7, IL-24 y E7 e IL-24 en la progresión del tumor en ratones C57BL/6 portadores de tumores TC-1.Se hizo un seguimiento de seis ratones portadores de tumores cada dos días para medir el tamaño del tumor durante seis semanas.La media del volumen tumoral de los ratones se muestra en la Fig. 8. Después de la tercera semana, el volumen tumoral de los grupos de estudio fue sustancialmente menor (P < 0,001) que el de los grupos de control.Las mediciones en la cuarta semana revelaron que aunque la diferencia entre el volumen del tumor de los grupos E7 e IL-24 y E7 no era notable, se observó un tumor más pequeño (P < 0,001) en ambos grupos en comparación con el grupo de IL-24.A partir de la semana 4, el volumen tumoral del grupo E7 e IL-24 siguió una tendencia de regresión importante, de modo que el tamaño tumoral de este grupo en las semanas 5 y 6 fue considerablemente menor (P < 0,001) que el de los grupos E7 e IL-24 .En base a estos resultados, la IL-24 puede mejorar de forma eficiente el potencial de regresión tumoral de la vacuna de ADN E7, especialmente a largo plazo.Eficacia de la vacuna de ADN y la terapia de combinación en ratones portadores de células tumorales (TC-1).El tejido tumoral se estableció mediante la inyección de células TC-1 (1 × 10,5) por vía subcutánea.Después de dos inmunizaciones, se calculó el volumen del tumor hasta la sexta semana después de la exposición al tumor.La comparación de la diferencia entre el grupo E7&IL-24 y otros grupos (grupos DNA E7, IL-24, pcDNA y PBS) fue significativa (p < 0,001).Los datos se representan como la media ± SD (n = 6 ratones por grupo).La importancia para la supervivencia del ratón se determinó mediante la prueba t de StudentPara investigar si la supresión de la citocina inmunosupresora IL-10 puede mejorar o no el resultado de nuestra vacuna adyuvante desarrollada, y en qué medida, se incorporó mAb anti-IL-10 a los componentes de nuestra receta de inmunización.Luego, los niveles de IFN-γ, IL-10 y caspasa-9, y también el tamaño del tumor en ratones que recibieron vacunas anti-IL-10 añadidas, se compararon con los de los ratones tratados con homólogos de isotipo seis semanas después de la exposición al tumor.Con respecto al nivel de IFN-γ, el bloqueo de IL-10 podría inducir niveles más altos de esta citocina en los grupos E7 e IL-24 (P < 0,001) y E7 (P < 0,05) en comparación con los grupos de control de isotipo (Fig. 9A).**P < 0,01;Métodos J Virol.Adv. Virol.Adv. Virol.Comp Immunol Microbiol Infect Dis.Ciencia del cáncer.Curr Opin Virol.Saltador;Biotécnicas.J Exp Clin Cáncer Res.Patentes de Google;2018.citocina.Adv. Virol.Expert Opin Ther Targets.Oncotarget.Hum Vacuna Inmunotro.Hum Gene Ther.MBío.Annu Rev Immunol.J Exp Clin Cáncer Res.J Biomed Sci.Cánceres.Sci Rep. 2018;8:1–11.Resolución de virusInmunol Lett.Hum Gene Ther.Mol Cáncer Ther.Microbio Patog.Microbio Patog.Oncogén.Oncol Lett.inmunol microbiol.Gene Ther.J Gen Med.Int J Mol Sci.Enfermedad de muerte celular.2020;11:1–13.Gen del cáncer Ther.Inmunología.Frente Oncol.J Clin Immunol.2014.Invertir en cáncer.Patobiología.Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.La renuncia de Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt© 2022 BioMed Central Ltd a menos que se indique lo contrario.